[h=2]انتقال t-dna از آگروباکتریوم به سلولهای گیاهی [/h] همان طور که در مطالب پیشین ذکر شد، بسیاری از پروتیینهایی که توسط ژنهای vir رمز میشوند، نقشی ضروری در فرآیند انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم دارند. برخی از این نقشها در چندین مقاله مروری برجسته شرح داده شده است، بنابراین در مقاله حاضر، نقشهای پروتیینهای Vir که میتوانند با هدف بهبود فرآیند انتقال ژن مورد دستورزی قرار گیرند، به طور محدودتری توضیح داده شده است. پروتیینهای VirA و VirG به عنوان عضوی از یک سیستم تنظیمی ژنتیکی دو بخشی حسی-ترارسانی پیام عمل میکنند. VirA یک شاخک پریپلاسمیک است که حضور ترکیبات فنلی گیاهی خاصی را در زمان زخم القا میشود، حس میکند. VirA با هماهنگی با یک مولکول حامل مونوساکاریدی به نام ChvE و در حضور مقدار مناسبی فنل و مولکول قند، خود و پروتیین VirG را فسفریله میکند. VirG در حالت غیر فسفریله غیرفعال است، اما در حالت فسفریله، این پروتیین به فعال شدن یا افزایش سطح رونویسی ژنهای vir کمک میکند. این کار احتمالاً از طریق برهمکنش با توالی جعبه-vir که بخشی از راهانداز ژنهای vir است، صورت میگیرد. پروتیینهای همیشه فعال VirA و VirG که نیازی به القاکننده فنلی برای فعالیت خود نداشته یا پروتیینهای VirG که برهمکنش بهتری با توالی جعبه-vir برای فعال کردن ابراز ژنهای vir داشته باشند، شاید برای بهبود کارآیی انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم و طیف میزبانی مفید باشد. VirD۴ به همراه ۱۱ پروتیین VirB، یک سیستم ترشحی نوع ۴ که برای انتفال T-DNA و چند پروتیین دیگر Virشامل VirE۲ و VirF لازم است، میسازند. شـایـد VirD۴ بـه عنــوان یـک پیونـددهنـده عمـل نمـایـد تـا برهمکنــش مـجـمـوعـه T-DNA/VirD۲ با سیستم ترشحی رمزشده VirB را افزایش دهد. بیشتر پروتیینهای VirB یا کانال غشایی میسازند یا به عنوان ATPase، انرژی لازم برای تشکیل کانال یا فرآیندهای خروج مولکولها را فراهم میکنند. چندین پروتیین شامل VirB۲، VirB۵ و احتمالاً VirB۷ در ساختن T-pilus شرکت دارند. VirB۲ اصلیترین پروتیین پیلین است. عمل پیلوس در انتقال T-DNA هنوز روشن نیست، ولی شاید به عنوان کانالی برای عبور T-DNA و پروتیینهای Vir عمل نماید یا شاید فقط به عنوان قلابی برای برقراری ارتباط با سلول گیاهی پذیرنده عمل نمایند و باکتری و گیاه در نزدیکی هم قرار داده تا انتقال مولکولی موثری صورت گیرد. جنبه مهم زیستشناسی پیلوس که شاید در انتقال ژن اهمیت داشته باشد، ناپایداری آن در حرارت است. گرچه حداکثر القا ژنهای vir در دمای ۲۵ تا ۲۷ درجه است، پیلوس برخی از سویههای آگروباکتریوم در دماهای پایینتر (۱۸ تا ۲۰ درجه)، پایدارتر است. آزمایشهای اولیه حاکی از اثر درجه حرارت بر انتقال ژن است. بدین ترتیب، برخی شاید کشت همزمان آگروباکتریوم و سلولهای گیاهی را در دمای پایین و طی چند روز آغازین فرآیند انتقال ژن مورد بررسی قرار دهند. پروتیینهای VirD۲ و VirE۲نقشی حیاتی و احتمالاً کاملکننده در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم بازی میکنند. گفته میشود که این دو پروتیین به همراه رشته T، مجموعهای به نام مجموعه T تشکیل میدهند که شکل انتقال شونده T-DNA میباشد. اینکه این مجموعه داخل باکتری سوار میشود یا نه هنوز مورد مباحثه است. Citovsky و همکارانش نشان دادهاند که VirE۲ میتواند داخل سلول گیاهی کار خود را انجام دهد: گیاهان تراریخته توتون که توانایی ابراز VirE۲ را کسب کرده بودند، با سویههای جهشیافته virE۲ آگروباکتریوم آلوده میشدند. چندین آزمایشگاه نیز نشان دادهاند که VirE۲ میتواند در غیاب رشته T به سلول گیاهی منتقل شود و ممکن است که مجموعه VirE۲ و رشته T، یا در کانال انتقال باکتری یا داخل سلول گیاهی تشکیل شوند. نتایج تحقیقات جدید حاکی از آن است که شاید VirE۲ نقش دیگری نیز در مراحل اولیه فرآیند انتقال ژن دارد: Dumas و همکارانش نشان دادهاند که VirE۲ در شرایط in vitro میتواند با مشارکت غشا مصنوعی، کانالی برای انتقال مولکولهای DNA خلق نمایند. بنابراین، ممکن است که یک وظیفه VirE۲، تشکیل سوراخی در غشا سیتوپلاسمی برای تسهیل عبور رشته T باشد. به دلیل اتصال VirD۲ به انتهای ۵′ رشته T، این پروتیین ممکن است به عنوان راهنمای این رشته برای عبور از کانال انتقالی نوع ۴ عمل نماید. VirD۲ همچنین ممکن است در مراحل دیگری از فرآیند انتقال ژن، در داخل سلول گیاهی، نقش داشته باشد. VirD۲ دارای توالی “پیام مکانیابی هستهای” (NLS) بوده که ممکن است در هدایت این پروتیین و T-DNA متصل به آن به سوی هسته سلول گیاهی، کمک نماید. توالی NLS در پروتیین VirD۲ میتواند مجموعههای T ساختهشده در آزمایشگاه که شامل پروتیینهای گزارشگر نیز میباشند، به هسته سلولهای گیاه، جانور و مخمر هدایت کند. از این گذشته، VirD۲ میتواند با چندین پروتیین Importin آرابیداپسیس از طریقی وابسته به NLS در مخمر و همچنین شرایط in vitro مشارکت نماید. Importin- بخشی از یکی از مسیرهای انتقال پروتیین هستهای است که در یوکاریوتها کشف شده است. دادههای اخیر نشان میدهد که VirD۲ به تنهایی برای انتقال مستقیم رشته T به هسته کافی نیست. Ziemienowicz و همکارانش نشان دادند که در سلولهای تراوا، VirD۲ میتواند در انتقال اولیگونوکلیوتیدهای کوچـک متصل به خـود، که در شرایـط in vitro ساخته شدهاند، به هسته موثر باشد، ولی نمیتواند مولکولهای بزرگ متصل را در انتقال به هسته هدایت کند. برای انتقال این مولکولهای بزرگتر، VirE۲ نیز باید به رشته T ملحق شود. نهایتاً شاید VirD۲ نقشی در ادغام T-DNA با ژنوم گیاهی بازی کند. جهشهای متعددی در VirD۲ میتواند هم در کارآیی و هم در دقت ادغام T-DNA تاثیر داشته باشند. درباره نقش VirE۲ در انتقال هستهای T-DNA هم مباحثاتی وجود دارد. VirE۲ یک پروتیین متصل شوند به توالیهای غیر اختصاصی DNA تک رشته میباشد. در سلولهای آگروباکتریوم VirE۲ شاید با VirE۱ برهمکنش داشته باشد و بنابراین نمیتواند برای اتصال به T-DNA در دسترس باشد. اما وقتی به DNA تک رشته متصل شود (احتمالاً در سلول گیاهی)، VirE۲ میتواند DNA با ساختار پیچیده اتفاقی را تبدیل به حالتی شبیه به سیم پیچیده تلفن نماید. این شکل طویل شده T-DNA، ممکن است به هدایت آن از طریق سوراخهای هسته کمک نماید. VirE۲ همچنین دارای توالیهای NLS بوده که ابه این دلیل میتواند پروتیینهای گزارشگر متصل به خود را به هسته سلول گیاه هدایت کند. VirE۲ مثل VirD۲ با پروتیینهای Importin- آرابیداپسیس در مخمر، از طریقی وابسته به NLS برهمکنش دارد. یک گزارش حاکی از آن است که VirE۲ به DNA تکرشته متصل شده و با ریز-تزریقی به داخل سلول گیاهی، میتواند DNA را به هسته هدایت کند، گرچه گزارشهای دیگر نشان میدهد که VirE۲ نمیتواند DNA تکرشته متصل به خود را به هسته سلولهای گیاهی یا جانوری که برای افزایش کارآیی جذب DNA از محیط، تراوا گشتهاند، رهنمون سازد. دلایل این نتایج متناقض نامعلوم است ولی شاید منعکسکننده تفاوتهای نوع سلولها و سیستمهای ارسال DNA که توسط دو گروه استفاده شده، باشد. استفاده از سویههای آگروباکتریوم که یک پروتیین VirD۲ جهشیافته فاقد NLS را رمز میکنند، برای ارسال T-DNA به سلول گیاهی، فقط باعث ۴۰ درصد کاهش کارآیی انتقال ژن میشود. گیاهان تراریخته که VirE۲ را ابراز میکنند، مکمل سویههای جهشیافتههای دوگانه آگروباکتریوم هستند که فاقد ژن virE۲ و دارای یک نقص در ناحیه رمزکننده NLS ژن virD۲ میباشند. این نتایج نشان میدهد که در صورت فقدان توالی NLS در پروتیین VirD۲، سایر سازوکارهای هدفگیری هسته (مثل VirE۲) جایگزین آن میشوند. وقتی VirE۲ به DNA متصل میشود، موتیف NLS آن مسدود و غیرفعال میشود. این موضوع به این علت است که دامنه NLS و دامنه متصل شونده به DNA پروتیین VirE۲ با هم همپوشانی دارند. گروه Hohn نظریهای ارایه کردهاند که طبق آن نقش اولیه VirE۲ در انتقال هستهای مستقل از NLS بوده و VirE۲ فقط به رشته T شکل میدهد تا بتواند از منافذ هسته با حرکات مارپیچی عبور کند. توانایی پروتیین VirE۲ در مکانیابی هسته سلولهای جانوری مورد بحث است. Ziemienowicz و همکارانش نشان دادهاند که در سلولهای تراوا شده Hela، نوع octopine پروتیین VirE۲ میتواند هسته را هدفگیری نماید در حالی که در سلولهای Drosophila و Xenopus که مورد ریزتزریقی قرار گرفته بودند، توالی NLS نوع nopaline پروتیین VirE۲ باید تغییر نماید تا این پروتیین تغییریافته در مکانیابی هستهای موثر باشد. گرچه دلیل این اختلاف مشخص نیست ولی احتمالاً به خاطر این نیست که یکی از دو گروه از VirE۲ نوع octopine و دیگری از نوع nopaline استفاده کردند. نهایتاً VirE۲ احتمالاً رشته T را از تجزیه نوکلیوتیدی در سیتوپلاسم و هسته گیاه محافظت میکند. وجود یک مجموعه T مرکب از یک تک مولکول VirD۲ که با پیوند کووالانت به انتهای ۵′ یک رشته T متصل شده است و به طور منظم توسط مولکولهای VirE۲ پوشیده شده است، به طور کلی توسط مجامع تحقیقاتی آگروباکتریوم پذیرفته شده است. اما بهتر است آگاه باشیم که این مجموعه تاکنون نه در آگروباکتریوم و نه در سلولهای گیاهی شناسایی نشده است. همچنین ممکن است سایر پروتیینها مثل Importin، VIP۱ و حتی VirF، هم به طور مستقیم و غیر مستقیم با رشته T برهمکنش داشته و مجموعه T طویلتری در سلول گیاهی تشکیل دهند. گرچه عموماً ژنهایvir رمز شونده توسط پلاسمید Ti به عنوان مهمترین عامل انتقال ژن مورد توجه هستند، بسیاری از ژنهای کروموزومی آگروباکتریوم نیز برای این فرآیند ضروری هستند. نقش ژنهای کروموزومی برای اولین بار با استفاده از جهشزایی اتفاقی کل ژنوم آگروباکتریوم مشخص شد. تحقیقات بعدی نقش بسیاری از این ژنها را مشخص کرد. این نقشها شامل تولید، تغییر و ترشح اگزو-پلیساکارید (pscA/exoC، chvA و chvB) و دیگر نقشها در اتصال باکتری به سلولهای گیاهی (ژنهای att)، ناقلین قند درگیر در القا ژنهای vir (chvE)، تنظیم القا ژنهای vir (chvD) و حمل T-DNA (acvB) میباشد. ژنهای دیگر مثل miaA، نیز ممکن است نقش کوچکی در فرآیند انتقال ژن داشته باشند. روشنشدن توالی کامل A. tumefaciens C۵۸، مطمیناً بستر مناسبی برای کشف ژنهای دیگری که در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم درگیر هستند، فراهم میکند.
